Extracción de proteínas totales para espectrometría de masas

### Descripción del Protocolo

NotaPasos

• Lisis
  • Se tiene que considerar que partiendo de una cantidad de 3 millones de células se obtiene aprox. 50\(\mu\)g de proteína. Transferir las células a un tubo falcon y centrifugar a 3500 RPM/ 5 min/ 4°C, retirar el sobrenadante.
  • Lavar 2 veces el botón celular con PBS (1X; 4ml/frío).
  • Recuperar el botón celular y añadir buffer de extracción de lisis (300\(\mu\)l), resuspender la muestra y transferir a un tubo eppendorf.
  • Sonicar 20 pulsaciones a media potencia (1 pulso:1 seg; descanso: 1 seg; en frío), evitar tocar las paredes del tubo).
• Reducción y alquilación
  • Incubar 30 min/40ºC. Añadir Tris (90\(\mu\)l, pH 8.6).
  • Agregar IAM (1M; 78\(\mu\)l), incubar TA/oscuridad/ 30 min.
• Precipitación de proteínas
  • Tomar 100\(\mu\)l del lisado y agregar 4 volúmenes acetona 99.5% (400\(\mu\)l).
  • Incubar toda la noche a -20°C.  Lavar el botón obtenido con acetona al 95% (200\(\mu\)l), resuspender con vortex y centrifugar a 14 000 RPM/15ºC/10 minutos, retirar sobrenadante. Realizar dos veces.  Descartar el sobrenadante y secar el botón a TA/~5 minutos.
• Determinación de proteínas  Resuspender el botón de proteínas en NH₄HCO₃ (50mM; 20\(\mu\)l) y CHAPS 5% (20\(\mu\)l). Agitar en vortex, no tocar la tapa del tubo (5 minutos).  Agregar urea (4M; 20\(\mu\)l), agitar en vortex 5 minutos.  Cuantificar proteína por Bradford: 300\(\mu\)l del reactivo + 10\(\mu\)l de muestra. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 595nm, extrapolar el dato obtenido en una curva estándar de proteína disuelta en NH₄HCO₃ (50mM; 20\(\mu\)l) y CHAPS 5% (20l), para obtener la concentración de proteína del lisado total.  Con base al dato obtenido del lisado celular, volver a precipitar solo el volumen necesario para obtener 50\(\mu\)g de proteína.  Resuspender el botón de proteínas en NH₄HCO₃ (50mM; 20\(\mu\)l) y GndCl (50mM; 100\(\mu\)l). Agitar en vortex, no tocar la tapa del tubo (5 minutos).
• Digestión de las proteínas  Añadir tripsina a una concentración 1g/l, agitar suavemente.  Incubar a 37 °C y en agitación por ≤18hrs.  Transcurrido el tiempo acidificar la muestra agregando TFA que quede con un volumen final al 0.1%.
• Desalado con SEP PAK C18  Preparar solución A: Agua Milli Q/TFA (0.1%) y solución B: Acetonitrilo/Agua Milli Q/TFA 60:40:0.1.  La muestra debe tener un pH2-3 sino acidificar la muestra con ácido fórmico o trifluoroacético (pH 2-3).  Activar la columna con 2ml de solución B (hacer pasar el volumen por una micropipeta o jeringa).  Equilibrar la columna con 3ml de solución A.  Pasar por la columna la muestra (en un volumen no menor de 500\(\mu\)l, si se tiene menos agregar solución A) dos veces y despacio; goteo no mayor a una gota por segundo.  Desalar con 5ml de solución A (eluir despacio).  Eluir con 500\(\mu\)l de solución B, recuperar el eluato y volverlo a pasar por la columna. Agregar 500\(\mu\)l más de solución B a la columna (hacerlo pasar solo una vez), para obtener un volumen final de 1ml.  Congelar la muestra (20 min a -80) y secar al vacío. Congelar los péptidos secos antes de ser analizados. Al momento de analizar resuspender en 50 \(\mu\)l agua ácida (FA 0.1%).

PrecauciónNotas

• Si el número de células ≥10 millones, agregar buffer de extracción de lisis (500$mu$l).

• Los pasos consecutivos se tienen que realizar si se tiene ≥ 3 millones de células; si hay una cantidad menor de células: primero precipitar todo el lisado, saltar los pasos siguientes hasta determinación de proteínas y resuspender el botón de proteínas en NH₄HCO₃ (50mM; 20\(\mu\)l) y GndCl (50mM; 100\(\mu\)l) y continuar con la digestión de proteínas.

@cite Geiger, T., Wehner, A., Schaab, C., Cox, J. & Mann, M.
Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals
ubiquitous but varying expression of most proteins. Mol. Cell.
Proteomics 11, M111.014050 (2012). @cite Aasebo EMO, Vaudel M, Farag
Y, Selheim F, Berven F, et al. Freezing effects on the acute myeloid
leukemia cell proteome and phosphoproteome revealed using optimal
quantitative workflows. J Proteomics. )2016).

Diagrama de Flujo

Figura

Anexos

Soluciones

Buffer de extracción

First Header	Second Header
SDS	4%
DTT	100mM
Tris	100mM, pH 8.6
Inhibidores de proteasas	1X
H2O	117$mu$l

Nomenclatura

CHAPS 3-(cloroamido propil)-dimetilamonio-1- propanosulfato DTT: ditiotreitol GndCl: cloruro de guanidinio IAM: iodoacetamida NH₄HCO₃: bicarbonato de amonio SDS: dodecilsulfato sódico TA: temperatura ambiente TFA: ácido trifluoroacético

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