Protocols
Colocar un vial de células congeladas en baño maría a 37°C, mover suavemente el vial hasta que las células se descongelen.
Transferir con una micropipeta el contenido a un tubo falcón 15ml y añadir 9ml de medio de cultivo suplementado (glutamina, antibióticos, 1% piruvato y 10% suero fetal bovino). Centrifugar a 1200rpm/5 minutos/4ºC (para lavar y quitar todo el DMSO).
Desechar sobrenadante y repite dos veces el proceso.
Resuspender las células en medio de cultivo y transferir a la botella de cultivo.
Observar las células al microscopio invertido.
Incubar a 37°C con 5% de CO2 y 80% de humedad relativa.
Cambiar el medio de cultivo según el tipo celular.
Limpiar el hemocitómetro con alcohol al 70%. Esperar a que esté secos por completo y colocar el cubreobjetos en de la rejilla.
Mezclar 10\(\mu\)l de una suspensión celular uniforme con 90\(\mu\)l de azul de tripano 0.4%. Incubar 2 min.
Colocar 10\(\mu\)l de la mezcla bajo el cubreobjetos y observar al microscopio con una magnificación 40x.
Contar las células sin colorante presentes en los cuadrantes 1, 2, 4 y 5 del hemocitómetro (Fig. 1) sin considerar las células que toquen las líneas.
Calcular concentración de células:
\[células/ml = \frac{células * 10^{5}}{volúmen}\]
- Calcular la viabilidad celular
\[viabilidad = \frac{células}{total}*{100}\]
- Limpiar el hemocitómetro con alcohol 70% y secar.
Precalentar a 37°C solución de PBS 1X y Solución de Hanks-SFB (5%).
Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical. Una vez muertos los ratones, realizar una incisión abdominal por planos por piel y peritoneo. Separar el intestino delgado del estómago y hacer un corte en el píloro gástrico. Eliminar el ciego y continuar hasta el recto.
Extraer cuidadosamente el intestino, retirar el tejido mesentérico adyacente y las placas de Peyer.
Cortar el intestino longitudinal de extremo a extremo y colocarlo en una bandeja con PBS 1X/37°C y agitar suavemente. Transferir a una nueva bandeja y repetir dos veces el proceso.
Cortar el intestino en fragmentos de 0.5cm y colocar en un tubo falcón (50ml): EDTA (2mM) en solución de Hanks-SFB (30ml). Agitar a 250 rpm/37°C/20 minutos.
Remover el tejido y repetir la incubación con soluciones frescas.
Cortar finamente el tejido en fragmentos de 1mm y agregar colagenasa tipo IV (1mg/ml) y DNasa I (800\(\mu\)g) disueltas en solución de Hanks-SFB (20ml). Poner en agitación continua 200rpm/37°C/10 minutos.
Pasar la solución por un colador celular de 100\(\mu\)m y colectar la suspensión celular, agregar 20ml de solución de Hanks-SFB frío. Centrifugar 1500 RPM/4°C/5 min.
Resuspender el botón celular y contar las células en la cámara de Neubauer.
Mezclar 3\(\mu\)l del vector exógeno con un vial de bacterias competentes.
Incubar 30 minutos en hielo.
Incubar 60 segundos a 42ºC.
Incubar 2 minutos en hielo.
Añadir 200\(\mu\)l de medio SOC, e incubar 37°C/200rpm/1hr.
Plaquear en agar LB con antibiotico de selección.
Incubar 12-16hrs a 37°C.
- TBD
- TBD
Disuelva 10 mg de zymosan de Saccharomyces cerevisiae (Sigma Z4250) en 50 ml de PBS estéril y luego diluya 10 veces para obtener una solución de trabajo de 20 mg/ml.
Autoclave a 121ºC durante 20 min.
Mantenga el zimosan esterilizado en autoclave en hielo.
Inyectar 0,5 ml de zymosan i.p. (10 mg/cavidad peritoneal del ratón; mezcle zymosan inmediatamente antes de la inyección para garantizar una suspensión uniforme) con una aguja 25G 5/8.
Esperar 4 h.
Sacrificar ratones por exposición a dióxido de carbono.
Realice una pequeña incisión (~0,5 cm) a lo largo de la línea media del abdomen que permita retirar la piel para exponerla el abdomen, que luego se rocía con etanol al 70%.
Inyecte 3 ml de solución de lavado de PBS/EDTA 2 mM helada con una jeringa y una aguja de 25G 5/8.
Masajee suavemente el abdomen del ratón con la longitud de una aguja de 11⁄2 de 18G para asegurarse de que las células sueltas adheridos a la pared peritoneal u otros órganos se desprenderán y quedarán suspendidos en el líquido de lavado.
Use una aguja 18G 11⁄2 para extraer suave y lentamente el líquido de lavado de la cavidad peritoneal. Transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 ml y manténgalo en hielo. Es posible que no obtenga los 3 ml debido a los volúmenes muertos en el peritoneo.
Transferir 200\(\mu\)l células a un tubo cónico de 15 mL, centrifugar y desechar el sobrenadante.
Teñir las células con los anticuerpos apropiados (CD45-PerCP, F4/80-PE/Cy7, Ly6G-APC) durante 15 min en hielo.
Lavar las células con tampón de tinción, seguido de resuspensión en 300\(\mu\)l de buffer de tinción. Agregar 30\(\mu\)l de perlas de conteo (30,000 partículas)
Ejecutar en el flujo.
Conocemos el número total de cuentas, por lo que los números absolutos de celdas se pueden calcular en relación con las cuentas. Debe multiplicar 15 veces, ya que de 3 mL se utilizaron 200 \(\mu\)l de exudado. (Número absoluto de celdas) = (recuento de celdas) / (recuento de perlas) X 30 000 X 15
Determinar el porcentaje de gel a preparar en base al tamaño de la molecula de ADN a analizar ([Tabla 1]).
Pesar la cantidad de agarosa requerida para la resolución deseada.
Disolver en 100ml de TAE 1X. Agitar.
Calentar la agarosa hasta que se disuelva por completo.
Agregar 4\(\mu\)l de SYBR Safe 10,000X.
Sellar completamente la base para preparación de geles de agarosa con cinta adhesiva y posteriormente vaciar la agarosa.
Colocar el peine y dejar que solidifique la agarosa. Una vez solidificado retirar la cinta adhesiva y el peine y colocar la base dentro de la cámara de electroforesis.
Agregar 200ml de TAE 1X (cubrir entre 0.5 o 1cm por encima del gel).
Mezclar las muestras de interés con buffer de carga (6X) y colocar cada una de las muestras en los pozos.
Colocar el marcador de peso molecular (marcador de peso molecular + buffer de carga 6X) en un pozo.
Cerrar la cámara de electroforesis y conectar a la fuente de poder.
Encender la fuente de poder, seleccionar voltaje constante de 100V y migrar durante 20 minutos.
Analizar el gel en el fotodocumentador utilizando el programa SYBR safe/green (488nm).