Descripción del Protocolo
NotaPasos
- Retirar el medio a las células.
- Agregar por las paredes del pozo 1 mL de PBS 1X estéril a las células, realizar movimientos circulares y tenues, para eliminar el medio. Repetir este paso 2 veces más.
- Retirar el PBS 1X y agregar 700 μL de paraformaldehído (PAF) al 4%, incubar a temperatura ambiente por 20 min.
- Eliminar el PAF con la pipeta y realizar 3 lavados con PBS 1X, ya descritos anteriormente.
- Agregar 500 μL de rojo oleoso a la monocapa e incubar a temperatura ambiente por 1 hora.
- Retirar el rojo oleoso y realizar 3 lavados con PBS 1X.
- Observar al microscopio.
PrecauciónNotas
- La adición y eliminación de los reactivos se realizará por las paredes del pozo, para evitar el desprendimiento de la monocapa de células.
- Para los lavados, los movimientos no deberán ser vigorosos porque puede provocar el desprendimiento de la monocapa de células.
- Los volúmenes que se mencionan en el procedimiento es para el tamaño de un pozo de placa 6 pozos, estos volúmenes se pueden adecuar de acuerdo al tamaño del pozo en donde se esté realizando la tinción.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Preparación de medios. a) Medio de crecimiento
Medio DMEM + 10% SFB + antibiótico/antimicótico + l-glutamina
Medios de diferenciación(MD) La siguiente tabla es descrita para 3 Ml de m, es decir para un pozo. Al medio de crecimiento se le adicionara los reactivos necesarios para preparar los medios de diferenciación
MD-I MD-II MD-III Dexamentasona 25 μM 30 μL 30 μL — IBMX 125 μM 12 μL 12 μL — Insulina 300 UI/mL 1 μL 1 μL 1 μL Rosiglitazona 20 mM — 3 μL de una dilución 1:10 (9 μL de medio de crecimiento + 1 μL de rosiglitazona 20 Mm) —
Documentos de ?@sec-ref
Zebisch K, Voigt V, Wabitsch M, Brandsch M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Analytical biochemistry. 2012;425(1):88-90.