Descripción del Protocolo
Precalentar a 37°C solución de PBS 1X y Solución de Hanks-SFB (5%).
Eutanasiar a los ratones por dislocación cervical. Una vez muertos los ratones, realizar una incisión abdominal por planos por piel y peritoneo. Separar el intestino delgado del estómago y hacer un corte en el píloro gástrico. Eliminar el ciego y continuar hasta el recto.
Extraer cuidadosamente el intestino, retirar el tejido mesentérico adyacente y las placas de Peyer.
Cortar el intestino longitudinal de extremo a extremo y colocarlo en una bandeja con PBS 1X/37°C y agitar suavemente. Transferir a una nueva bandeja y repetir dos veces el proceso.
Cortar el intestino en fragmentos de 0.5cm y colocar en un tubo falcón (50ml): EDTA (2mM) en solución de Hanks-SFB (30ml). Agitar a 250 rpm/37°C/20 minutos.
Remover el tejido y repetir la incubación con soluciones frescas.
Cortar finamente el tejido en fragmentos de 1mm y agregar colagenasa tipo IV (1mg/ml) y DNasa I (800\(\mu\)g) disueltas en solución de Hanks-SFB (20ml). Poner en agitación continua 200rpm/37°C/10 minutos.
Pasar la solución por un colador celular de 100\(\mu\)m y colectar la suspensión celular, agregar 20ml de solución de Hanks-SFB frío. Centrifugar 1500 RPM/4°C/5 min.
Resuspender el botón celular y contar las células en la cámara de Neubauer.
- Es importante mantener las soluciones a 37ºC.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Solución de Hanks
| Header 1 | Header 2 |
|---|---|
| HBSS | 4.75g |
| Bicarbonato de sodio | 0.17g |
| HEPES | 1.2g |
| SFB | 25ml |
| H2O | Aforar a 1L |
Reactivos
HBSS Sigma H2387
Material
muchos tubos falcon 50 ml