Descripción del Protocolo
Corroborar la presencia del fragmento de ADN de interés.
Con una navaja de bisturi limpia, cortar la agarosa lo más cercano a la banda de ADN, tratar de adquirir el menor volumen de gel. Se recomienda tener un volumen 200mg.
Colocar en tubo de centrifuga de 1.5 ml.
Agregar 200\(\mu\)l de buffer de extracción y mezclar.
Incubar la mezcla a 50-58°C por 10 minutos o hasta que el gel se encuentre completamente disuelto. Invertir el tubo por unos minutos para facilitar el proceso de fundición.
Adicionar 200\(\mu\)l de etanol (96-100%) y mezclar.
Transferir la muestra a la columna de purificación de ADN.
Centrifugar la columna de 30-60 segundos a 14,000xg, descartar sobrenadante y colocar la columna de purificación de ADN en el tubo de colección.
Agregar 200\(\mu\)l de buffer de prelavado (suplementado con etanol) a la columna de purificación de ADN y centrifugar por 30-60 segundos a 14,000xg.
Descartar el sobrenadante y colocar la columna de purificación nuevamente en el tubo de colección.
Adicionar 700\(\mu\)l de buffer de lavado (suplementado con etanol) a la columna de purificación de ADN y centrifugar de 30-60 segundos a 14,000xg. Repetir este paso.
Descartar el sobrenadante y colocar la columna de purificación nuevamente en el tubo de colección.
Centrifugar la columna de purificación de ADN 1 minuto a 14,000g para remover por completo el buffer de lavado. Este paso es esencial para remover el etanol en la solución purificada de ADN. La presencia de etanol puede inhibir las reacciones enzimáticas.
Transfiera la columna de purificación de ADN a un tubo de micro centrifuga 1.5ml limpio.
Adicionar 10\(\mu\)l de buffer de elución a la columna de purificación de ADN, centrifugar por 1 minuto a 14,000g, para eluir el ADN.
Descartar la columna de purificación y guardar el ADN purificado a -20°C.
Si el fragmento de ADN extraído se utilizará en experimentos de clonación, exponer pocos segundos a luz UV o colocar una placa de plástico o vidrio sobre el gel agarosa durante la iluminación con UV.
Para geles de agarosa ≥1% prolongar el tiempo de incubación 15 minutos.
Si el fragmento de ADN es ≥10kb centrifugar la columna por 2 minutos a 14,000g.
El volumen recomendado de buffer de elución es 6-10\(\mu\)l, si es ≤10\(\mu\)l baja el rendimiento de ADN. Si el fragmento de ADN es ≥10kb el volumen de elución debe incrementar entre 15-20\(\mu\)l para obtener un óptimo rendimiento. No es recomendado un volumen de elución menor 10\(\mu\)l.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Documentos de ?@sec-ref
(cite?) Manual de “GeneJet gel extraction and DNA Cleanup micro kit”. Thermo Scientific Current Protocols in Molecular Biology, Section 2.6.1, Supplement 59. Frederick M. Ausubel et al. 2003.