Descripción del Protocolo
Determinar el porcentaje de gel a preparar en base al tamaño de la molecula de ADN a analizar (Tabla 1).
Pesar la cantidad de agarosa requerida para la resolución deseada.
Disolver en 100ml de TAE 1X. Agitar.
Calentar la agarosa hasta que se disuelva por completo.
Agregar 4\(\mu\)l de SYBR Safe 10,000X.
Sellar completamente la base para preparación de geles de agarosa con cinta adhesiva y posteriormente vaciar la agarosa.
Colocar el peine y dejar que solidifique la agarosa. Una vez solidificado retirar la cinta adhesiva y el peine y colocar la base dentro de la cámara de electroforesis.
Agregar 200ml de TAE 1X (cubrir entre 0.5 o 1cm por encima del gel).
Mezclar las muestras de interés con buffer de carga (6X) y colocar cada una de las muestras en los pozos.
Colocar el marcador de peso molecular (marcador de peso molecular + buffer de carga 6X) en un pozo.
Cerrar la cámara de electroforesis y conectar a la fuente de poder.
Encender la fuente de poder, seleccionar voltaje constante de 100V y migrar durante 20 minutos.
Analizar el gel en el fotodocumentador utilizando el programa SYBR safe/green (488nm).
Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas debajo de los peines y de ser así, eliminar antes de correr el gel.
Permitir a la agarosa en polvo hidratarse en la solución durante unos minutos antes de calentar: esto permite una disolución más sencilla, rápida y reduce la formación de espuma.
Para prevenir el sobrecalentamiento de la agarosa, si se usa un microondas sacar el vaso de precipitados después de 1 minuto y mover cuidadosamente. Volver a colocar dentro del microondas y continuar 1 minuto más. Si se hierve demasiado tiempo puede causar hidrólisis y una menor fuerza de resolución del gel.
@cite 10.1002/9780470089941.et0702s10Diagrama de Flujo
Anexos
Tabla 1
| Tamaño | Concentración |
|---|---|
| >2kb | 0.6% |
| 1-2 | 0.8% |
| 0.5-1 | 1% |
| 0.2-0.5 | 1.5% |
| <0.2 | 2% |
Soluciones
Preparación de TAE
| Reactivo | Concentración |
|---|---|
| Tris | 40mM |
| Ácido Acético | 20mM |
| Na2EDTA | 1mM |
| H2O | aforar a 1L |
Reactivos
UltraPure Agarose Thermo
SYBR Safe Thermo
Buffer carga 6X Promega
Marcador de peso molecular Thermo
TAE 1X S