Descripción del Protocolo
Picar una colonia de bacterias, cepas TOP10 o DH5\(\alpha\), y colocar en 15ml de caldo LB (Luria-Bertani) sin antibiótico.
Incubar a 37°C/200rpm/12-16 hrs.
Transferir 10ml del crecimiento bacteriano a 200ml de caldo LB estéril sin antibiótico.
Incubar a 37°C/200rpm y medir la densidad óptica a 600nm cada hora.
Una vez llegado a una densidad óptica de 0.6 colocar el cultivo bacteriano en tubos falcón de 50ml fríos.
Centrifugar a 5000rpm/30 minutos/4°C.
Desechar el sobrenadante y resuspender las bacterias en 10ml de CaCl2 0.1M frio.
Centrifugar 10 minutos/5000rpm/4°C.
Desechar el sobrenadante y resuspender las bacterias en 10ml de CaCl2 0.1M frio.
Incubar una hora en hielo.
Centrifugar 5000rpm/10 minutos/4°C y eliminar el sobrenadante.
Añadir 2ml de CaCl2 y 20% glicerol frío.
Incubar 5 minutos en hielo.
Preparar alícuotas de 100\(\mu\)l.
Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido.
Almacenar a -70°C.
Todo debe realizarse bajo el mechero en condiciones de esterilidad.
Todos los reactivos e insumos utilizados deben de ser estériles.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
CaCl2
| Header 1 | Header 2 |
|---|---|
| CaCl2 | 11.098g |
| H2O | 100ml |
Ajustar pH a 7.5 y esterilizar
Reactivos
CaCl2 Sigma
Documentos de ?@sec-ref
(Ramos2014?) Manual de “pENTR™ Directional TOPO Cloning Kits” life technologies Current Protocols in Molecular Biology, Section 1.2.1, Supplement 59. Frederick M. Ausubel et al. 2003.