Descripción del Protocolo
- Al cDNA de la muestra adicionar 100uL de agua MiliQ dilución 1:5 En una placa de 96 pozos para PCR añadir para cada muestra por triplicado los 25 uL de reacción para el gen GAPDH (housekeepin gene) en los pozos y para el gen de interés el volumen de 25uL de la reacción como se muestra en la tabla 1 de los Anexos. Homogenizar las reacciones. Cubrir la placa con las películas adhesivas. Analizar las muestras siguiendo la programación de la reacción se muestra en la tabla 2 de los Anexos.
Notas: Antes de usar cualquier reactivo homogenizarlo. Durante el proceso mantener todos los reactivos en hielo. Realizar la preparación en un periodo de tiempo corto Asegúrese de homogenizar correctamente las reacciones finales. Verificar que los pozos no contengan burbujas y que el volumen final de la reacción se encuentre en la superficie del pozo.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Documentos de ?@sec-ref
(cite?) Shain KH, Dalton WS, Tao J. 2015. The tumor microenvironment shapes hallmarks of mature B cell malignancies. Oncogene 34:4673-4682.
- Anexos
Tabla 1. Preparación de la reacción: Componente Volumen final 25 uL SYBER green Master Mix qPCR 12.5 uL Primer Fw (10 mM) 1 uL Primer Rv (10 mM) 1 uL cDNA (1:5) 1uL Agua MiliQ 9.5 uL
Tabla 2. Programación qPCR: Paso Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 94°C 5 minutos 40 ciclos 94°C 60°C 72°C 30 segundos 30 segundos 1 minuto Nota: Temperatura de adquisición 60°C Reactivos y Soluciones SYBER Green Master Mix qPCR Primer Fw 10 mM Primer Rv 10 mM Agua MiliQ