Descripción del Protocolo
NotaPasos
- Descongelar células 3T3-L1. Esperar a que el criovial se descongele un 60%, y colocarlo en un tubo de 15 mL con medio de crecimiento.
- Centrifugar a 600 rpm por 5 minutos.
- Decantar el sobrenadante, con los residuos de medio que quedan el tubo, resuspender las células.
- Al tubo, agregar 3.5-5 mL o 7.5-10 mL para una botella de 25 cm2 y 75 cm2, respectivamente y transferir las células a su respectiva botella. Incubar.
- Una vez que las células presenten una confluencia mayor al 80%, cosecharlas. Decantar el medio, lavar la monocapa de células con 3 mL de PBS 1X dos veces, agregar 2 mL de tripsina e incubar a 37°C por 5 minutos, agregar 2 mL de medio de crecimiento.
- Contar las células por el método de hemocitometría. Se sugiere realizar una dilución 1:2.
- En placas tratadas de 6 pozos, colocar 1x105 células por pozo, en 2 mL de medio de crecimiento. Incubar por aproximadamente 18 horas o hasta que se forme la monocapa de células.
- Una vez formada la monocapa, retirar todo el medio y agregar 3mL de MD-I, incubar.
- Retirar el 70% del medio y agregar 3mL de MD-II, incubar por 4 días.
- Transcurrido el tiempo, retirar el 70% de MD-II y añadir 3mL de MD-III, incubar por 4 días.
- Terminado el tiempo de incubación con el MD-III, retirar el 70% del medio y agregar 3mL de medio de crecimiento e incubar por 1 semana. Si durante este tiempo las células requieren cambio de medio, realizarlo de la manera ya antes descrita.
PrecauciónNotas
- No realizar diferenciaciones con un pase celular arriba de 10. Las incubaciones se deben realizar a 37°C, 5% CO2. Durante la diferenciación de las células se observará un cambio morfológico, aproximadamente en el día 12. La presencia de gotas de lípidos podrá ser observadas en las células a partir del día 8. Durante el proceso de diferenciación no debe perderse más del 10% de células. Los volúmenes que se mencionan es para los pozos de una placa de 6 pozos, estos volúmenes se pueden adecuar dependiendo del tamaño de pozo que se ocupe. El número de células es para el tamaño de pozo de una placa de 6 pozos, se puede adecuar el número de células de acuerdo al tamaño de la superficie en donde se realizará la diferenciación, la confluencia deberá ser de 80-90%.
Diagrama de Flujo
Anexos
Soluciones
Preparación de medios. a) Medio de crecimiento
Medio DMEM + 10% SFB + antibiótico/antimicótico + l-glutamina b) Medios de diferenciación(MD) La siguiente tabla es descrita para 3 Ml de m, es decir para un pozo. Al medio de crecimiento se le adicionara los reactivos necesarios para preparar los medios de diferenciación
MD-I MD-II MD-IIIDexamentasona 25 μM 30 μL 30 μL — IBMX 125 μM 12 μL 12 μL — Insulina 300 UI/mL 1 μL 1 μL 1 μL Rosiglitazona 20 mM — 3 μL de una dilución 1:10 (9 μL de medio de crecimiento + 1 μL de rosiglitazona 20 Mm) —
Documentos de ?@sec-ref
Zebisch K, Voigt V, Wabitsch M, Brandsch M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Analytical biochemistry. 2012;425(1):88-90.